Od 1627 roku w Domu Panieńskim razem z dziewczętami zamieszkały nauczycielki, które pomagały Zofii Czeskiej w pełnieniu dzieła. Założycielka była dla nich wychowawczynią i mistrzynią. Chociaż na początku nie stanowiły wspólnoty zakonnej, jednak prowadziły życie wspólne pracując razem i uczestnicząc we wspólnych nabożeństwach. Pierwsze nauczycielki czasem opuszczały Dom Panieński szukając innej formy życia. W „Przedmowie Fundatorki” do Ustaw abo sposobu życia Domu Panieńskiego Zofia Czeska pisała, że dla dobra wychowanek i zaradzenia różnym trudnościom, które pojawiły się w ciągu kilku lat od powstania Fundacji, postanowiła założyć Zgromadzenie, którego celem byłoby poświęcenie się sprawie wychowania i kształcenia dziewcząt.

            W 1630 roku Zofia Czeska przeżyła trudny moment odejścia wikarii czyli zastępczyni z Domu Panieńskiego, Anny Stobińskiej, która postanowiła wstąpić do Karmelitanek Bosych. W Historii Domowej Domu Panieńskiego prowadzonej od 1621 roku kronikarka zanotowała, że wychowawczynie często dla większego zysku opuszczały Fundację Zofii Czeskiej szukając lepszego zarobku w dworach szlacheckich, wychodząc za mąż lub wstępując do istniejących już zakonów.

            Matka Zofia Czeska myśląc perspektywicznie o dalszych losach Domu Panieńskiego, pod koniec swojego życia, postanowiła związać przez złożenie ślubu te współpracownice, które deklarowały gotowość poświęcenia się i pracy dla dziewcząt do końca życia. Nie posiadając własnej reguły, posłużyła się Konstytucjami Konserwatorium istniejącego przy kościele św. Eufemii w Rzymie. Przyjęła tę regułę, ponieważ była ona już zatwierdzona przez Kościół i najbardziej odpowiadała charyzmatowi jej dzieła. Do reguły wprowadziła jednak „małą odmianę porządku i rzeczy” przystosowując zasady życia do warunków polskich i nazwała ją – Ustawami abo sposobem życia Domu Panieńskiego. Poprzedziła też te ustawy własną przedmową. Zaznaczyła, że pragnie założyć Zgromadzenie, którego członkinie zajmowałyby się wychowaniem i kształceniem młodych dziewcząt.

            Wychowawczynie, które zdecydowały się przyjąć zasady zaproponowane przez Matkę Czeską ubrały strój zakonny. Kiedy Założycielka umierała 1 kwietnia 1650 roku Zgromadzenie nie posiadało jeszcze zatwierdzenia Stolicy Apostolskiej. Na przeszkodzie stanęły trudne wydarzenia, które spadły na Rzeczpospolitą. W 1651 roku pojawiła się dżuma, która w ciągu następnych lat zebrała wielkie żniwo śmierci. W 1653 roku Kraków nawiedziła powódź. W 1655 roku nieszczęściem dla Krakowa stał się „potop” szwedzki. Broniący miasta Stefan Czarniecki kazał spalić przedmieścia. Dwuletnia okupacja miasta przez Szwedów doprowadziła do całkowitego zubożenia mieszkańców.

            Po śmierci Matki Zofii Czeskiej jej następczyni, Matka Katarzyna Albiczówna we współpracy z Biskupem krakowskim Piotrem Gembickim podjęła starania o zatwierdzenie Zgromadzenia przez Stolicę Apostolską. 25 lutego 1658 roku papież Aleksander VII nadał na prośbę biskupa Piotra Gembickiego dwa odpusty: 21 listopada z okazji święta patronalnego dla kaplicy Ofiarowania NMP, jaka istniała w domu na ulicy Szpitalnej w Krakowie oraz wspomnienia św. Zofii, przypadającego 15 V.