Dzieje obrazu Matki Bożej Świętojańskiej w kościele Panien Prezentek nie są do końca znane. Dokumenty klasztoru mówią, że obraz podarował do kościoła św. Jana w Krakowie około 1577 roku książę litewski Stanisław Radziwiłł, po powrocie z pielgrzymki do Compostelli w Hiszpanii. „Dosłowny zapis brzmi: „Książę Radziwiłł … Obraz Najświętszej Panny z Litwy wywiózł i do tego kościoła św. Jana w Krakowie ofiarował”.Książę Stanisław Radziwiłł był nawróconym na katolicyzm kalwinem, który ze względu na swoją gorliwość neofity został nazwany „pobożnym”. W latach 1576-1577 odbył on pielgrzymkę do Hiszpanii razem ze swoim bratem Jerzym, późniejszym kardynałem.
Przed obrazem Matki Bożej Świętojańskiej modlił się król Jan III Sobieski po zwycięstwie nad Turkami pod Wiedniem. Przybył do kościoła św. Jana w nielicznej asyście 23 lutego 1684 roku, by dziękować Bogu za zwycięstwo odniesione nad wrogami chrześcijaństwa przez pośrednictwo Najświętszej Maryi Panny. W sto lat później 24 marca 1794 roku Tadeusz Kościuszko, po przysiędze złożonej na krakowskim rynku przed obrazem Matki Bożej prosił Boga, aby mógł wypełnić przysięgę, że wypędzi z Polski rozbiorców. W ciągu następnych wieków przed ołtarzem Matki Bożej Świętojańskiej modlili się Krakowianie w czasach wojen światowych i innych zawieruch, jakie nawiedzały Ojczyznę. Szczególna modlitwa o wolność ducha rozbrzmiewała tu w czasach zniewolenia komunistycznego. Przewodził jej kard. Karol Wojtyła zapalając przy ołtarzu Matki Bożej nadzieję na nową wolność.
Obraz Matki Bożej Świętojańskiej przedstawia postać Matki Bożej z Dzieciątkiem Jezus na lewej ręce na złotym tle. Matka Boża ubrana jest w płaszcz koloru ciemnozielonego, który nakrywa także głowę. Płaszcz jest spięty ozdobną klamrą. Spod płaszcza widać ciemną suknię przepasaną zielonkawym paskiem. Maryja w prawej ręce trzyma kwiat białej koniczyny. Dzieciątko Jezus przytula się do Matki. Lewą ręką podtrzymuje księgę położoną na kolanie a prawą ma wzniesioną w geście błogosławieństwa. Ubrane jest w sukienkę koloru ciemnolila, spod której widać bose stopy Dzieciątka.
Teologiczną treścią obrazu wzorowanego na wschodnim typie Hodegetrii jest prawda o Bożym Macierzyństwie Maryi. Matka Boża ukazuje swojego Syna Jezusa podkreślając prawą ręką, że trzeba Go słuchać. Dzieciątko symbolizuje Jezusa Nauczyciela i Władcę, który w ręku trzyma Księgę Życia.
Obraz Matki Bożej ofiarowany do kościoła św. Jana był początkowo umieszczony przy bocznym filarze, a gdy zasłynął w 1633 roku łaskami, został w roku 1639 przeniesiony do głównego ołtarza. Kultem Matki Bożej Świętojańskiej zajmowali się księża z Kościoła Mariackiego, na terenie, którego jest położony kościół św. Jana. Od 1726 roku rozwojem nabożeństwa do Matki Bożej od wykupu niewolników zajmują się Siostry Prezentki, którym kościół został przekazany przez ówczesnego biskupa krakowskiego Konstantego Feliksa Szaniawskiego. Od tego czasu kult Matki Bożej Świętojańskiej stał się częścią charyzmatu Zgromadzenia założonego przez Matkę Zofię Czeską.